氨基己糖生物合成途径(HBP)、O-GlcNAc信号

磷酸戊糖途径(PPP)

线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）

线粒体钙单向转运体(MCU)

定量质谱quantitative mass spectrometry assay：

IL-2 signaling：T细胞激活过程中的增殖、功能作用[effector、memory T都需要]；调控effector-memory反应；Treg的产生与维持。但是在naive CD8+T的priming中不怎么关键

IL-2Rα含有2个sushi domains (SD)，为与IL-2结合所必需

SUSD2：单次I型跨膜蛋白，C端有SD结构域。胞质段很短，可能不能直接产生下游信号。该文尝试验证SUSD2是否通过与CD8+T膜表面其他蛋白相互作用从而调节CD8+T功能。

SD结构域以β-三明治结构为基础，介导蛋白-蛋白相互作用。许多human cancers中都报告了SUSD2的表达：乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、胃癌、结直肠癌。肿瘤细胞上SUSD2的表达与肿瘤生长的关系（正相关或负相关）与肿瘤类型有关

1.Antitumor immune responses are improved in Susd2−/− mice

小鼠荷瘤：

对象——8-10周龄雄鼠、雌鼠；位置——皮下；细胞数——1x10^6

流式：

消化肿瘤——将肿瘤剪碎后使用1mg/ml IV型胶原酶+50U/ml DNase I，37℃，30min

过滤——70um滤网，制成单细胞悬液

染色

*p-STAT5胞内染色：

固定细胞——2%多聚甲醛paraformaldehyde，室温，10min

打孔——预冷的甲醇methanol，4℃，20min

洗3次——PBS+2%FBS+1mM EDTA

染色

*肿瘤浸润淋巴细胞的胞内细胞因子染色【IFN-γ、Gzmb、TNF、IL-2】

细胞体外刺激+蛋白转运抑制剂——50ng/ml 佛波酯PMA{PKC激活剂}+500ng/ml 离子霉素+【2种蛋白转运抑制剂】GolgiStop(莫奈霉素){作用于蛋白在内质网的累积阶段}+GolgiPlug(BFA){作用于蛋白在高尔基体的累积阶段}

如前所述一样染表面

固定、打孔——使用BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)

染胞内

*染核内【Foxp3、TCF-1】

如前所述一样染表面

固定、打孔——使用Foxp3 Fix/Perm Buffer Kit

染核内

*细胞凋亡分析

重悬细胞——使用annexin-V Binding Buffer

染凋亡——annexin-V与7-AAD viability solution，25℃，15min

annexin-V染凋亡的原理：annexin-V为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异性结合。在细胞凋亡早期，只分布在正常细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）翻向外侧，用标记了荧光素的Annexin V作为荧光探针，并搭配PI、7-AAD、DAPI等核酸染料使用，能够准确区分正常细胞、凋亡早期和凋亡晚期细胞。

死活染料：PI、DAPI、7-AAD，与细胞内部DNA结合。活细胞因为细胞膜具有选择透过性所以不会染上荧光。但如果做胞内或者核内染色实验，细胞已经经历了固定破膜的步骤，这种染料就不再适用了。所以这时候就需要使用另一种染料——新型的氨基结合染料（FVS系列荧光染料）

多维流式Multi-dimensionalflow cytometry assay

光谱流式Spectralflow cytometry analysis

抗体清除CD8+T：

对照组：IgG，200ug实验组：CD8 Ab，200ugAtD0、7、14未说明注射方式（腹腔注射❓）

给PD-L1 Ab/PD-1 Ab：

腹腔内注射，250ug，D7、10、13

2.Susd2−/− CD8+ T cells show enhanced antitumor function

RT-PCR:

RNA提取——使用Trizol试剂

逆转录合成cDNA——使用Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，38℃，60min

RT-PCR——使用iTaq Universal SYBR Green Supermix in CFX Connect Real-Time PCR Detection System

IP+IB:

①IP提取蛋白样品:

裂解细胞——RIPA buffer+Protease Inhibitor Cocktail

孵育蛋白提取物——goat anti-V5 agarose或anti-Flag M2 Affinity Gel，4℃，于轻柔搅拌下过夜

洗5次——cold RIPA buffer

将蛋白从beads上洗脱——样本与30ul SDS sample buffer共孵育，95℃，10min

蛋白样品即存在于上清中

②IB分析提取的蛋白样品：

蛋白电泳——使用NuPAGE系统，根据说明书进行操作

FACS-based CD8+T体外杀伤细胞毒性实验：

给MC38，EG7，B16-OVA打上CFSE标签

用OVA257-264 pulse MC38 tumor cells——at 1 ug/ml，1h

体外活化的OT-1 T与 OVA257-264-pulsed tumors cells共孵育——不同比例，4h

用7-AAD进行死活染色，跑流式

体外抗原递呈：

BMDC与OVA257-264共孵育——1ug/ml OVA257-264，37℃，2h。用PBS洗3次

脾脏OT-1 T细胞分选——磁珠分选

OT-1 T与BMDC共孵育——比例5：1，96孔板

体外Treg-Naïve CD4+T 增殖抑制实验：

naive CD4+T刺激——1x10^5 CFSE-labeled naive CD4+CD25-细胞，用1ug/ml anti-CD3 Ab+1ug/ml anti-CD28 Ab刺激

Treg分选——磁珠分选

Treg与CD4+T共孵育——at different ratios【保留一个只有CD4+T的阳性对照】

3天后流式

T细胞过继转移实验：

prime Thy1.2+ OT-1 T with OVA257-264 for 3 days

Thy1.1+ WT鼠荷EG7(1x10^6 cells, 皮下)，7天后尾静脉注射Thy1.2+ OT-1 T(4x10^6 cells)

3.SUSD2-IL-2Rα interaction requires SD

逆转录病毒转导（SUSD2）实验：

用逆转录病毒向SUSD2-/- OT-1 T转导V5-tagged Susd2或empty vector（对照）

进行V5 agarose immunoprecipitation+LC-MS/MS[液相色谱-串联质谱]

步骤：

OT-1 T被置于6孔板中，用1ug/ml OVA257-264刺激24h

加入病毒所在的上清液（1：1vol/vol ratio）+8ug/ml 凝聚胺polybrene

32℃，2h，at 800×g。

2h后更换media，再用OVA257-264培养OT-1 T 48h

4.SUSD2 negatively regulates IL-2R signaling

IL-2-induced STAT5 activation has been shown to be important for increasing the suppressive activity of Treg cells

IL-2 binding assay：

1×10^6 OT-1 T细胞与biotinylated IL-2共孵育，100ul PBS+0.1% BSA，20min，4℃

PBS洗3次，使用steptavidin-PE染色，30min，4℃

（同时也要做一份平行对照，OT-1 T与未标记的IL-2共孵育）

流式

6.Deletion of Susd2 improves antitumor efficacy of CAR T cells

Cas9 nucleoprotein (RNP) complex electroporation：